Les antitoxine fonctionnels montrent une composition de porte érotique

Derrière principalement de comptes, quelques-uns renvoyons à la réf. 51. Quelques-uns fournissons des commandes utilisant des exécutables à cause le dictionnaire accompagné et des moment pile ce délivrance à cause https://github.com/DavidBJaffe/enclone/blob/master/enclone_paper/which_code_does_what. Une barrière peut dépendre utilisée pile fixer l’possible et télécharger les moment (https://10xgenomics.github.io/enclone/). Quelques-uns avons servant la interprétation 0.5.175 de Enclosure. S’bourreau sur des moment, ce délivrance nécessite lourdement 145 Go de anamnésie et 20 à 40 minutes sur un barman multicœur (24 cœurs). En tellement que arbitre, quelques-uns avons forgé un registre pile tout alvéole (https://plus.figshare.com/articles/dataset/Dataset_supporting_Functional_antibodies_exhibit_light_chain_coherence_/20338177 ?) derrière une barrière par alvéole, pile dégauchir l’récit précise des moment pile ce délivrance par d’singulières balance. Il existe puisque des fichiers pile tout alvéole .old_data (https://plus.figshare.com/articles/dataset/Dataset_supporting_Functional_antibodies_exhibit_light_chain_coherence_/20338177 ?) et per_cell_stuff.phad (https://plus.figshare.com/articles/dataset/Dataset_supporting_Functional_antibodies_exhibit_light_chain_coherence_/20338177 ?) analogique aux singulières moment utilisées. L’habitude d’singulières exécutables nécessite une copiage à disparaître du dictionnaire avènement aligné à cause https://github.com/DavidBJaffe/enclone, qui se trouve à cause son tarif enclone_paper/src/bin. Ces lithiase (émouvant fréquemment même fichiers d’antichambre même per_cell_stuff) ont été exécutés sur un MacBook Pro derrière 16 Go de anamnésie.

Cytométrie en tour

Quelques-uns avons servant le crible de cellules Sony MA900 pile clarifier des suspensions de cellules B particuliers de PBMC provenant des quatre donneurs décrits à cause cet recherche. Quelques-uns avons servant les définitions de Flow Gate suivantes pile tout empêché : gille : en direct, CD3CD19+IgD+CD27±CD38±CD24±; Exposé non convertie : en direct, CD3CD19+CD27+IgDun peuIgM++CD38±CD24±; Hôtel de anamnésie : en direct, CD3CD19+CD27+IgDCD38±CD24±CD95±; et plasmablast : subsistant, CD3CD19+CD27+IgDCD38++CD24.

Le échantillon d’antitoxine que quelques-uns avons servant réalisait mélangé des huit clones suivants derrière un cubage de coloris de 200 μl, synthétique 1,25 μg d’antitoxine derrière tout antitoxine à une tranchage de 1:40 (5 μl) : couleur subsistant/grippe (Invitrogen, 7-AAD, 00 -6993- 50), anti-CD3 (BioLegend, BV711, 317327, calque OKT3, IgG2a/kappa, souris), anti-CD19 (BioLegend, PE, 982402, calque HIB19, IgG1/kappa, souris), anti-IgD ( BioLegend, APC) , 348221, calque IA6-2, IgG2a/kappa, souris), anti-IgM (BioLegend, PE/Dazle 594, 314529, calque MHM-88, IgG1/kappa, souris), anti-CD24 (BioLegend, BV605, 311123, calque ML5, IgG2a/kappa, souris), anti-CD27 (BioLegend, FITC, 302805, calque O323, IgG1/kappa, souris), anti-CD38 (BioLegend, BV421, 356617, calque HB-7, IgG1 /kappa, souris) ) et anti-CD95 (BioLegend, BV510, 305639, calque DX2, IgG1/kappa, souris).

Quelques-uns avons titré et fixe un échantillon de éparpillement de cellules B derrière 20 millions de PBMC agio (AllCells, 3050363) provenant d’un généreux bienfaisant en plaisante disposition lequel les cellules n’ont pas été utilisées pile proliférer des moment unicellulaires à cause cette agence. Quelques-uns avons décongelé les cellules suivant le entente clarifié à 10 génomes de cellules mononucléaires de foyer imprimante bienfaisant froidement congelées pile le séquençage d’ARN protiste (CG00039, radoub D). En abject, quelques-uns avons retardé en crainte les cellules à cause 20 μl de PBS/2% FBS et incubé les cellules sur de la raide boucle 30 min à cause l’amphibologie. Monsieur le tri, quelques-uns avons lavé les cellules à cause 3 × 1 ml de PBS/2% FBS avec les avons remises en crainte à cause 300 μl de PBS/2% FBS pile l’période de tri.

Conception de moment de alvéole farouche

L’débordement de cellules provenant de quatre donneurs a été classé même gille, anamnésie altérée, anamnésie non transformée et plasmablaste. Le foyer des donneurs a été prélevé suivant les protocoles approuvés par la Crédit de l’nomadisme et du prescription de sinistré derrière alignement éclairé accablé par AllCells (une annexe de Discovery Life Sciences); Annulé carcasse sanatorium n’a été gouverné et aucune interrogation pour sa part perceptible n’a été rapportée à cause cette agence ou ses moment. Les séquences V(D)J ont été acquises à l’coadjuteur d’une belvédère de profilé protecteur génomique 10x, à l’coadjuteur de six saleté Chromium X HT et de méthodes de agencement courant. Les banques d’ADNc ont été séquencées sur la programme NovaSeq 6000 sur des Flow Cells S4. Certaines populations de lymphocytes B anamnésie voyaient assez spécifiques comme nous donneurs. Derrière commenter ceci, à cause certaines bibliothèques, quelques-uns avons annexé des cellules B naïves aux cellules anamnésie isolées de tout généreux moyennant de ferrer un assistance convenablement méprisant de cellules B totales et de séquences particuliers de tout généreux (se référer à puisque le graphique de moment abondant 1). Quelques-uns avons ciblé 20 000 cellules extraites de tout truchement sur la chip HT.

Indication accidentel

Quelques-uns avons servant contradictoires singulières ensembles de moment. Celles-ci comprenaient des moment unicellulaires pile 247 516 cellules de Phad et al.36, répartis couci-couça puisque convaincu les un duo de donateurs. Le moindre assortiment cerné (« anciennes moment ») comprenait des moment générées par 10x Genomics pile le redoublement en captif, distribuées derrière une squame, de la sorte que contradictoires singulières ensembles de moment liés à la figé en inscriptions.31covid1932,33Attaque de Kawasaki34 et LIBRA-seq35.

Certaines de ces moment ont prévenu la incertain classification et ont montré des signaux de bariolage (c’est-à-dire de traversée d’table) à cause une Flow Cell affirmation. Comme de exacts cas, quelques-uns avons traité les cellules de contradictoires donneurs même propre à un esseulé généreux. Ensuite la ingestion, il y avait 23 donneurs et un in extenso de 280 669 cellules à cause les anciennes moment.

Clause accidentel sur les paires de cellules d’un même généreux

Des paires de cellules ont été sélectionnées à disparaître de étranges modèles de clones calculés (Fig. 1b). Pendant de restituer peu possible que les un duo de cellules appartiennent au même certain phylotype, quelques-uns avons en contraint obligé qu’au moins une des trio occurrence O.K. repue : (1) Les moment appuient une habitude différente du gène de la porte ramassée J pile les un duo de cellules. Derrière ceci, quelques-uns avons analysé la territoire à quatre trames pile les un duo de cellules. Il devait y travailleur au moins trio positions où les séquences de renvoi voyaient distinctes, les cellules avaient des bases compatibles derrière celles-ci, aucune emplacement où les séquences de renvoi voyaient distinctes et les cellules ne supportaient qu’une distincte renvoi. (2) Mêmes standards que (1) exclusivement pile la porte érotique au canton de la porte ramassée. (3) Les longueurs de la porte érotique CDR3 variaient.

Mièvrerie de suite

Quelques-uns avons servant soNNia v0.1.2 et fonctionnaire 85c7169 pile contrefaire 10 répétitions pile 1 408 939 jonctions de chaînes lourdes. L’cadre Rééditable Conda et les scripts de source de ces fichiers et moment de caricature sont fournis à cause https://plus.figshare.com/articles/dataset/Dataset_supporting_Functional_antibodies_exhibit_light_chain_colusion_/20338177?file=36354231. Quelques-uns avons formé un duo de modèles soNNia utilisant des séquences annotées naïves en actualité sélection et post-sélection, et un duo de modèles utilisant des séquences annotées en anamnésie en actualité sélection et post-sélection.

Preuve répertoire

Récit de commission de la homogénéité des chaînes légères

Quelques-uns avons exécuté un copie de suppléance pile la composition de la porte érotique en commutant les moment de la porte érotique, en laissant les moment de la porte ramassée constantes, avec en calculant la réciprocité de la porte érotique convaincu les paires de cellules même à cause la armoiries 1, en utilisant une distincte alvéole par modèle de calque pile rétrécir le coude probable de expansions clonales. Quelques-uns avons exécuté 1000 permutations à des facultés de composition de porte érotique comprises convaincu 0% et 100% par pas de 10% avec affecté l’absurdité espèce de la norme à tout plan. Quelques-uns montrons ces courbes sur la armoiries 1a. Quelques-uns avons testé la distinction convaincu les coefficients de éloignement des modèles de éloignement linéal pile ces courbes en utilisant la paie des carrés F un audition.

Cinquièmeh/Cinquièmeà carcasse d’obligation

Quelques-uns avons testé la clef de la érudit V.h/Cinquièmeà Échelle de artificialité (où tout assistance est un espèce de calque derrière la érudit V.h/Cinquièmeà couple) en utilisant la caricature de Énergumène Carlo 100 000 s Calculer.

Tracés de logo de suite

Quelques-uns avons servant le registre ggseqlogo52 et msa53 Packages R pile tracer les séquences CDRH3 et CDRL3 derrière l’méthode MUSCLE et pile proliférer des tracés de logo à l’coadjuteur des informations d’entropie/informations de Shannon (y Harmonie d’charnière : bit). Les scolarité sont colorées en caricature des propriétés des étranges acides aminés. Le codification fardant de la avoir des acides aminés et d’singulières codes primordiaux pile enfanter ces chiffres sont à la prédisposition du évident à cause le adapté de cet recherche.

induction d’allèle

Les allèles donneurs du gène V sont incomplètement déduits (à cause le adapté du développement accompagné, à cause le registre allele.rs), en utilisant l’méthode disciple. Le image de ammoniaque est d’intégrer les séquences observées d’un gène V étonnant et d’différencier les bases variables. Si quelques-uns utilisions toutes les cellules (une suite par alvéole), la suite serait biaisée par l’relâchement clonale et entraînerait de la sorte des allèles incorrects. Théoriquement, quelques-uns utiliserions préférablement une distincte alvéole par modèle de calque en utilisant le gène V. Purement, l’tour des actions est que quelques-uns comptons d’extérieur les allèles donneurs, avec quelques-uns comptons les modèles de duplication. Quelques-uns utilisons de la sorte une habitude heuristique pile cliqueter des cellules qui ne reposent pas sur la contact des modèles clonaux. L’induction est que quelques-uns sélectionnons une distincte alvéole entre celles utilisant le gène V exclusif, qui division la même quantité de CDRH3, la quantité de CDRL3 et les un duo de gènes partenaires V et J. L’accroissement est subséquemment générée à disparaître de la suite du gène V de ces cellules. .

En conséquence, pile tout positionnement le élevé du gène V, à l’restriction des 15 dernières bases (pile sauter la territoire de intersection), quelques-uns déterminons la immunité des bases rencontres à cause ces cellules particuliers. Quelques-uns ne considérons que les situations à cause lésiner une ammoniaque hormis renvoi se contrecoup au moins quatre coup et représente au moins 25 % du in extenso. En conséquence, tout alvéole a une marque digitale pile ces positions, qui est la détail des balises de ammoniaque patte les positions moment ; Quelques-uns exigeons que ces empreintes répondent à des critères de affirmation pareils. En conséquence, tout marque digitale non référencée identifie un « allèle dichotomique ». Quelques-uns ne limitons pas le assistance d’allèles alternatifs car ils peuvent procéder de copies de gènes en incertain. La prédisposition de l’méthode à rétablir les allèles est limitée par la proportion de housse (décidée à cause des cellules « non redondantes ») du gène V. De principalement, l’méthode ne peut pas différencier les mutations germinales qui se produisent aux bases finales du gène V, à cause la territoire de intersection. Un exposé d’invective d’allèle peut dépendre trouvé à cause la réf. 51à cause la chapitre sur l’récit des références des donneurs.

Récapitulatif du relation

Alors d’informations sur la création de la soigné sont disponibles à cause le inventaire des contraventions de soigné sur la complexion lié à cet recherche.

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